…ледует добавлять в горячую среду, если только вы не собираетесь скомпенсировать потерю пероксида при разложении, добавляя большее его количество. В связи с тем, что пероксид приобретает свойства отбеливателя при температуре выше 60о С, он будет легко разлагаться при контакте с комплексными органическими материалами при температурах от 60о С и выше. Таким образом, перед добавлением пероксида вам придется подождать, пока среда остынет – если не до комнатной температуры, то хотя бы до такой, которую терпит рука.

В противовес своему поведению в чистом растворе или стерилизованной среде, пероксид быстро разлагается в присутствии пероксидразрушающих энзимов, как это случается при промывании раствором пероксида ран. Разрушенные клетки кожи и кровеносных сосудов, находящиеся в ране, в изобилии содержат пероксидразрушающие энзимы, что вызывает быстрый распад пероксидного раствора и выделение пузырьков кислорода. Похожие энзимы, называемые каталаза и пероксидаза, найдены во всех разновидностях живых или бывших живыми тканях, если только они не подвергались температурному воздействию или глубокой переработке. Таким образом, необработанное зерно, мука, опилки, дерево и т.д. будут разлагать пероксид за короткое время. Это означает, что вам придется избегать контакта раствора пероксида с подобными материалами при хранении. Это также означает, что если вы хотите включить указанные материалы в состав питательной среды, вам придется удостовериться в том, что перед добавлением пероксида все компоненты среды были подвергнуты тщательной тепловой обработке с целью уничтожения пероксидразрушающих энзимов.

Я предпринимаю определенные меры для обеспечения чистоты раствора пероксида при его хранении. Перед забором пероксида я, в первую очередь, протираю пробку и верхнюю часть бутылки спиртовым раствором, чтобы удалить частицы, которые могут содержать живые микроорганизмы.

После этого я либо отливаю пероксид в пастеризованный мерный цилиндр, либо отбираю раствор с помощью чистой, пастеризованной пипетки, снабженной на верхнем конце ватным тампоном-фильтром. Пипетки не нуждаются в автоклавировании, но их требуется, как минимум, обрабатывать в течение нескольких минут кипятком (заполняя выше верхней градуировочной отметки, но ниже ватного тампона), а затем остужать перед тем, как производить забор пероксида.

Градуированный цилиндр объемом 100 мл может послужить удобным сосудом для погружения 10 мл пипетки в кипяток. Нагревание убьет все живые организмы, а пероксид уничтожит оставшиеся термоустойчивые споры. Я также слежу за тем, чтобы не допускать закручивания пробки на бутылке, если пробка контактировала с источником заражения.

Различия в концентрации пероксида, поступающего от производителей

Суровая правда жизни состоит в том, что 3% (согласно этикетке на бутылочке) раствор перекиси водорода, приобретенный вами в аптеке или магазине, на самом деле может иметь несколько иную концентрацию. Концентрация может заметно отличаться как в сторону больших, так и в сторону меньших значений. В какой-то степени можно избежать недоразумений, если не покупать просроченную перекись, проверяя срок истечения ее годности на этикетке (если он указан) и покупая заведомо свежий раствор (например, на бутылках, которые покупаю я, указан только месяц истечения срока годности, а год – не указан). Тем не менее, даже указанный срок годности не дает абсолютной уверенности в том, что концентрация действительно составляет 3%. Поэтому важно уметь измерять концентрацию пероксида в растворе. Простой способ такого измерения основан на разложении пероксида из пробного образца раствора и измерении количества высвобожденного кислорода, которое я осуществляю с помощью надувного шарика.

Вот мой способ измерения примерной концентрации пероксида:

Возьмите чистую пробирку (предпочтительно с отвернутым краем на горлышке или с накручивающимся колпачком), небольшой надувной шарик и ломтик гриба такого размера, который может быть легко помещен в пробирку. Ломтик можно вырезать из ножки гриба, а кожицу нужно снять, чтобы обнажить большое количество разрушенных клеток. Самые лучшие результаты получаются с молодыми, быстро растущими грибами. Если под рукой не окажется грибов, можно использовать кусочек банана или другого фрукта, покрытого кожурой. Понадобятся также раствор пероксида, резиновое колечко, пастеризованная измерительная пипетка, мерный цилиндр на 100 мл и кастрюлька с водой.

1. С помощью пастеризованной пипетки отберите 5 мл раствора пероксида из бутылки и перенесите его в пробирку.
2. Поместите ломтик гриба на верхнюю часть пробирки (пока не допускайте попадания ломтика в пероксид).
3. Освободите шарик от воздуха и натяните его на горлышко пробирки (пробирку держите наклоненной, чтобы ломтик гриба не соскользнул в раствор, пока шарик не поставлен на место).
4. Зафиксируйте резиновым колечком шарик на горлышке пробирки, чтобы газ не начал выходить наружу по мере повышения давления (я считаю наиболее эффективным использовать резинку от порванного колечка, которой можно плотно обвязать шарик на горлышке пробирки).
5. После того, как шарик сел на место, стряхните ломтик в раствор пероксида. Раствор должен немедленно вспениться из-за выделения пузырьков кислорода.
6. Взбалтывайте пробирку. Раствор пероксида должен по большей части разложиться в течение пяти или десяти минут, в зависимости о количества каталазы/пероксидазы в грибном ломтике.
7. Когда разложение почти закончится, вы увидите, что выделение пузырьков замедлилось, а сами пузырьки стали довольно мелкими. Шарик, тем временем, должен подняться и стать упругим, т.к. он наполнится высвобожденным кислородом.

Со времен занятий по химии в колледже я помню, что 5 мл 3% раствора перекиси водорода должны произвести примерно 49 мл кислорода, если пероксид полностью разлагается при комнатной температуре и атмосферном давлении. Измерить количество кислорода, выделенного при разложении пероксида, можно в следующем порядке:

1. Наполните градуированный мерный цилиндр водой и поставьте его вверх ногами в кастрюлю с водой, удостоверившись, что в цилиндре нет пузырьков воздуха.
2. Перекрутите шарик у горлышка пробирки, чтобы кислород не выходил наружу, снимите шарик с пробирки, крепко удерживая скрученную часть, и поместите шарик под воду в кастрюле.
3. Аккуратно выпускайте газ из шарика в перевернутый мерный цилиндр так, чтобы газ замещал находящуюся в цилиндре воду.
4. Удерживая открытый конец мерного цилиндра под водой, определите по нанесенной на цилиндр шкале значение объема кислорода.

Когда я проделал такое измерение в первый раз, у меня получилось 52 мл газа внутри градуированного цилиндра от разложения 5 мл раствора пероксида. Учитывая, что в сдутом шарике перед началом измерения могло оставаться до 3 мл воздуха, раствор пероксида произвел количество кислорода, весьма близкое к теоретическому значению для 5 мл 3% раствора.

Теперь рассмотрим, как вычисляется нужное количество раствора пероксида, если тест дает значения концентрации выше или ниже 3%:

1. Разделите объем кислорода, ожидаемый от 5 мл 3% раствора (49 мл, если шарик совершенно пустой или 52 мл, как в рассмотренном выше примере, учитывая несколько миллилитров воздуха, оставшихся в шарике) на объем кислорода, который вы действительно получили.
2. Умножьте предыдущее значение на объем раствора пероксида, который вы добавили бы к среде или субстрату, если бы это был 3% раствор (это значение приводится в соответствующих разделах этой книги; например в разделе, посвященном агаровой культуре, вам будет нужно добавить 6 мл 3% пероксида к 1 л стерилизованной агаровой среды).

Информация о точной концентрации пероксида наиболее важна, когда вы приготовляете агаровые чашки (см. ниже), так как вам придется работать с концентрациями, которые близки к нижнему порогу эффективности. При изготовлении посевного мицелия вы будете иметь дело с заметно более высокими концентрациями, так что возможностей для вариаций будет больше. Для приготовления основного субстрата я использую меньше пероксида, чем для посевного мицелия, но и в этом случае остается некоторая свобода для подбора концентраций. Я рекомендую производить тест с шариком для каждой новой бутылки с раствором пероксида, который используется для работы с агаром а также проверять пероксид, который используется для посевного и основного субстрата, если только вы полностью не уверены в надежности поставщика. Поступая таким образом, вы будете совершенно уверены, что культура защищена настолько, насколько это ожидается. Не исключено, что вам придется провести исследование местного рынка и выбрать продавца, который предоставляет наиболее надежный продукт. Звучит парадоксально, но может оказаться, что самый дешевый вариант является также и самым лучшим, потому что регулярный оборот продукции на складе поставщика будет там, где пероксид дешевле. Если пероксид отсутствует в ваших местных магазинах, то есть смысл поискать его на фирмах, занимающихся поставкой химреагентов. Они зачастую предлагают 30% или 35% раствор пероксида, который можно затем развести. Магазины, обслуживающие бассейны, также могут предлагать пероксид в подобной концентрации. Имейте в виду, однако, что столь концентрированные растворы гораздо более опасны, чем стандартный 3% раствор. Прочтите все предупреждающие надписи на этикетке бутыли и соответствующе обращайтесь с этим раствором.

Выращивание агаровых культур и уход за ними

Первой стадией выращивания грибов является размножение грибной ткани (мицелия) на агаре в чашках петри и последующий уход за ней. Полученные первичные культуры используются для хранения, размножения и поддержания грибных штаммов в здоровом состоянии путем последовательных пересевов, а также для инокуляции вторичных культур – посевного мицелия.

Подготовка чашек петри.

Существует немало рецептов агаровых сред, которые могут быть использованы для выращивания грибного мицелия на чашках петри. Я испробовал некоторые из них, но в настоящее время использую только один: мальт-дрожжевой агар (солод-дрожевой агар, malt yest agar), известный также как MYA. Этот агар подходит практически для любого вида грибов, которые я пробовал выращивать. Данная среда не настолько питательна, чтобы немедленно подвергнуться заражению, хотя многие штаммы распространяются по чашке петри на MYA за две или три недели. По моему мнению, при использовании пероксидных сред нет особой необходимости в более быстром росте мицелия, потому что быстрое зарастание среды заставит вас производить пересевы на новые чашки для того, чтобы сохранить мицелий свежим. Кроме того, после нескольких последовательных переносов мицелия из чашки в чашку могут возникнуть проблемы со старением (сенесценцией) мицелия и поэтому некоторые грибоводы рекомендуют в таких случаях начинать все заново, используя сохраненную эталонную культуру. Согласно такому подходу, чем быстрее мицелий растет, тем раньше его придется поместить на хранение, поэтому я бы предпочел мицелий, который растет относительно медленно.

Я работаю с культурами в чашках петри, которые растут на среде, содержащей пероксид. Заражения на пероксидных чашках случаются редко и при соблюдении некоторых мер предосторожности вам не придется покупать ламинарный шкаф или строить главбокс для того, чтобы оградиться от контаминантов. Вы можете наполнять чашки на открытом воздухе на кухне. Хранить и заращивать чашки можно где угодно, лишь бы это место было относительно чистым, а условия внешней среды были бы подходящими для роста мицелия. Тем не менее, обратите внимание на рекомендации в конце этого раздела.

Мальт-дрожжевой агар, MYA

Вот рецепт, который я использую для приготовления 1 литра мальт-дрожжевого агара:

*
          o 12 г агара
          o 12 г тонко размолотого солода
          o 1 г пищевых дрожжей
          o 0.5 г муки ( у меня идет такая ротация сортов: пшеница, рожь, кукуруза, рис, овес, просо)
          o 0.5 г кроличьего корма (или другого гранулированного корма для животных)
          o 4–5 г гранулированных опилок (количество гранул может быть увеличено для дереворазрушающих видов грибов, которые хуже растут на агаре)
          o 1 л воды из-под крана


Если вы приобретаете в магазине готовую смесь для приготовления мальт-дрожжевого агара, то она, скорее всего, уже будет содержать первые три ингредиента: агар, солод и дрожжи. Остальные ингредиенты вы можете добавить самостоятельно. Сверьте по инструкции производителя, сколько смеси рекомендуется добавлять к 1 л воды. Обычно требуется примерно 40 или 50 грамм. В зависимости от количественного соотношения агара и солода, можно сократить количество смеси вдвое от рекомендованного и получить среду, которая лучше подходит для длительного и здорового роста мицелия.

Я приготавливаю агаровую среду для чашек в такой последовательности:

1. Смешиваю все ингредиенты в банке с необходимым количеством воды. Банка должна быть в два раза больше по объему, чем объем полученной среды, чтобы агар не выплескивался при закипании во время приготовления.
2. Корректирую pH среды, добавляя небольшое количество питьевой соды (моя вода является кислотной, но если у вас вода щелочная, то можно добавить немного уксуса. Смотрите также замечания об измерении pH субстрата в главе, посвященной приготовлению основного субстрата).
3. Стерилизую среду в скороварке, агар при этом растворяется. (Я использую воду из-под крана без всяких проблем. Более того, когда я растил мицелий на среде, приготовленной на дистиллированной воде, рост мицелия был заметно более медленным). Свободно накрываю банку крышкой и стерилизую в скороварке под давлением 1 атм. в течение не более 10 минут, предварительно дав агару разойтись в течение 10 минут перед тем как закрыть клапан давления. (Если вы приобрели готовую смесь для MYA-агара, в инструкции к ней может быть указано значительно большее время стерилизации, например, 45 минут. Не делайте этого! 20 минут – это более, чем достаточно, а при дальнейшей стерилизации будут образовываться вредные для мицелия продукты карамелизации среды). Вместе со средой я стерилизую также и набор чашек петри, поместив их в большую консервную банку из-под томатов, накрытую фольгой (я использую пластиковые чашки петри многократного использования и одного литра агара хватает на то, чтобы наполнить около 30 чашек).
4. По окончании стерилизации я осторожно убираю скороварку с плиты и сбрасываю давление пара. Аккуратно вынимаю банку со средой и ставлю ее на стол остывать на открытом воздухе. Нет никакой необходимости беспокоиться о попадании в банку не стерильного воздуха, если воздух более-менее свободен от пылевых частиц. Контаминанты, попавшие в банку с воздухом, погибнут после добавления в среду пероксида.
5. Когда банка остынет и ее можно комфортно брать руками, я помещаю ее в кастрюлю с горячей водой, потому что при этой температуре агар уже близок к застыванию.
6. Добавляю раствор пероксида с помощью пастеризованной пипетки и быстро перемешиваю среду круговыми движениями банки, изменяя пару раз направление вращения. Я стараюсь избегать образования большого количества пузырьков, которые потом могут остаться на поверхности агара.
7. После добавления пероксида я немедленно перехожу к чашкам петри, которые к этому времени расставлены на чистом столе. Свободно разливаю среду в чашки, накрывая их крышками после заполнения агаром.
8. После того, как агар застынет, я убираю чашки на несколько дней на слегка прикрытый лоток, чтобы подсушить агаровую среду.

Агар, приготовленный без автоклавирования

Если у вас нет скороварки или вы не хотите ее использовать, вы все равно можете приготовить защищенные агаровые чашки путем кипячения или обработки паром агаровой среды. При этом придется несколько изменить рассмотренную выше рецептуру. Вам нужно будет заменить ингредиенты, содержащие пероксидразрушающие энзимы на другие ингредиенты, которые не содержат таких энзимов. В рассмотренных ранее рецептах агар, солод и гранулированные опилки не содержат пероксидразрушающих энзимов, а дрожжи, мука и корм для кроликов – содержат. Для того, чтобы использовать агаровую среду, нам обычно приходится обрабатывать ее в скороварке, чтобы уничтожить пероксидразрушающие энзимы в этих ингредиентах. Тем не менее, указанные ингредиенты могут быть заменены на другие. Дрожжи служат источником витаминов, поэтому их можно заменить небольшим количеством свежего витаминного драже группы В. Поскольку витаминные препараты производят искусственным путем, они не содержат энзимов. Молотое зерно и кроличий корм являются источником белка, поэтому эти ингредиенты можно заменить на другие пероксид-совместимые протеиновые добавки. В общем случае, только подвергнутые глубокой переработке субстанции не содержат пероксидразрушающих энзимов, например, желатин, соевое молоко, обезжиренное сухое молоко и т.п. Для того, чтобы проверить исследуемую добавку на наличие энзимов, смешайте небольшое ее количество с 3% раствором пероксида и наблюдайте на появлением пузырьков. Отсутствие пузырьков означает отсутствие энзимов.

Вот рецепт для приготовления 1 литра агара без стерилизации в скороварке:

*
          o 12 г агара
          o 12 г мелко перемолотого солода
          o 0.5 г источника азота (следует производить ротацию этого компонента, например: желатин, соевое молоко, сухое молоко и т.п.)
          o 5–7 опилочных гранул
          o небольшой кусочек витаминного драже группы В (0.1 г ? ориентиром может служить появление легкой желтой окраски)
          o 1 л чистой воды, без каких-либо частиц


1. Прокипятите банку с этой средой (а также чашки петри) в кипящей воде в кастрюле, закрытой массивной крышкой, в течение примерно 45 минут, что позволит агару раствориться и уничтожит все живые организмы в среде (чашки петри можно стерилизовать даже дольше).
2. Выньте банку, дайте ей остыть и добавьте пероксид, как в первом рецепте. Пероксид убьет все споры, оставшиеся в среде. Я добавляю немного больше пероксида в не-автоклавированные чашки, примерно 8 мл на литр среды. Опыт показывает, что не-автоклавированные чашки в среднем подвергаются зараженьям чаще, чем автоклавированные пероксидные чашки, но и в этом случае результаты заметно лучше, чем при использовании чашек без пероксида.

Следите за образованием подтеков агаровой среды, которые остаются на внешней стороне чашек петри. Если их не вытирать, они через несколько дней покроются плесенью и затем споры плесени проникнут внутрь чашек и начнут прорастать на внешней кромке агара.
Если вы, как и я, работаете с чашками петри многократного использования, очищайте их тщательным образом от старого агара. Даже самое незначительное количество старого агара, оставшегося в чашке, если оно не контактирует с пероксидом в свежем агаре, при последующем использовании чашки может обрасти плесенью и послужить своеобразным трамплином для последующего заражения.

Наполнение чашек охлажденной агаровой смесью дает определенное преимущество, которое заключается в заметно меньшем образовании конденсата на внутренней поверхности верхней чашки, чем при заливке горячей смеси. Совершенно очевидно, что в этом случае вам не придется принимать дополнительных мер по борьбе с конденсатом, таких как стряхивание капель с верхних чашек или подогревание чашек для испарения капель. Через более прозрачные чашки будет легче наблюдать за тем, что в них происходит. Тем не менее, поверхность агара все-таки требует некоторого подсушивания, поэтому я оставляю перед использованием открытые чашки на день при комнатной температуре, слегка прикрыв их пергаментной бумагой для защиты от пыли. Чашки с агаром, которые были обработаны паром, получаются более влажными, чем те, в которых агар был стерилизован в скороварке (т.к. температура обработки была ниже, а время обработки – меньше), поэтому их приходится подсушивать в течение более длительного времени.

Если после заполнения чашек у вас осталось некоторое количество неиспользованного агара, его можно сохранить в стерильном виде в холодильнике. Когда вы решите снова использовать его, вы можете повторно расплавить агар, но в этом случае вам также придется снова добавить в среду пероксид, потому что нагрев агара до температуры плавления вызовет разрушение пероксида, добавленного в первый раз.

Приобретение грибных культур

Есть несколько путей приобретения грибного мицелия для дальнейшего выращивания на агаре. Можно прорастить грибные споры в питательной среде. Можно извлечь в асептических условиях ткань из свежего гриба и бережно перенести на агар для дальнейшего роста. Можно также купить грибную культуру у коммерческого поставщика, обычно в форме агара в пробирке или чашке петри.

В связи с тем, что пероксидсодержащая питательная среда убивает грибные споры, я пока что не занимался проращиванием спор для получения грибной культуры. Напротив, я предпочитаю приобретать грибной мицелий у поставщиков с проверенной репутацией. Я смотрю на это следующим образом: поставщик уже проделал непростую работу по изоляции грибного штамма с нужными качествами и, покупая грибную культуру, я с достаточной степенью уверенности приобретаю мицелий, имеющий точно такие же качества. Для контраста, если вы пытаетесь вырастить грибной штамм, который был изолирован после проращивания спор или клонирования, и он не плодоносит, вы не будете знать, где сокрыты причины неудачи: в условиях роста или самом штамме (споры подобны семенам: их генетические характеристики могут совпадать с родительскими, а могут и не совпадать). Вы можете потратить массу времени впустую, пытаясь добиться плодоношения от бесполезного штамма. Более того, если вам удастся в заданных условиях изолировать культуру и вы по каким-то причинам потеряете ее, то, если культура не была приобретена у коммерческого поставщика, вы не сможете просто вернуться к поставщику и получить дополнительную «копию» штамма. Вам придется получить новый штамм, отвечающим определенным условиям.

Когда вы покупаете грибную культуру у коммерческого производителя, подразумевается, что эта культура будет использована для выращивания (и, если вы так решите, продажи) посевного мицелия, субстратных блоков или плодовых тел данного грибного штамма. Также подразумевается, что вы не будете использовать приобретенную культуру для организации собственного банка штаммов и продавать агаровые культуры другим с целью коммерции. Если вы хотите продавать агаровые культуры, то из соображений этики, вам нужно будет клонировать мицелий из дикорастущих образцов или получить его, проращивая споры.

Клонирование грибов

Как бы то ни было, клонирование собственной грибной культуры из диких образцов, собранных на природе, также может быть увлекательным. Возможно, вам удастся получить плодоносящий штамм первого порядка. Если вы захотите попробовать произвести клонирование, вам потребуются несколько чашек с пероксидным агаром (см. ниже), скальпель, спиртовка и свежий гриб.

Для того, чтобы клонировать гриб:

1. Очистите его внешнюю поверхность, чтобы на ней не осталось отдельных частиц мусора.
2. Разломите шляпку гриба (или основание ножки) для получения открытой ткани. Сделайте это настолько чисто, насколько возможно.
3. Зажгите спиртовку и простерилизуйте на пламени лезвие скальпеля. Вырежьте из гриба небольшой кусочек чистой ткани, которая не контактировала с внешней поверхностью. Эту операцию, очевидно, проще провести с более толстым, мясистым грибом, нежели с тонким образцом.
4. Когда кусочек гриба окажется на скальпеле, переместите его на середину одной из агаровых чашек. В связи с тем, что вероятность неудачи остается достаточно высокой, по возможности, сделайте еще несколько переносов на отдельные чашки.
5. В заключение, поместите стопку чашек в чистый пластиковый пакет и поставьте их в подходящее место для инкубации при комнатной температуре.
6. Растущий мицелий, в случае успеха, должен стать заметным через несколько дней, распространяясь по сторонам от кусочка грибной ткани.

Плесень или бактерии тоже могут начать свой рост. В этом случае вам может потребоваться вырезать небольшой кусочек чистого мицелия и перенести его на свежую чашку. Если вы решите произвести дополнительное клонирование мицелия из зараженной плесенью чашки, сделайте это до того, как плесень приобретет темную окраску и созреет до образования спор. В противном случае, вы просто будете переносить плесень вместе с мицелием.

Если вы попытаетесь клонировать мицелий из дикорастущего гриба, запомните, что имеющийся в вашей питательной среде пероксид водорода, сам по себе, не сможет очистить мицелий от находящихся в нем источников заражения. Если исходный материал загрязнен и вы не можете получить чистую ткань путем разламывания ножки или шляпки гриба, который вы собираетесь клонировать, пероксид в агаре уже ничем не поможет. Пероксид не является стерилизующим агентом. Вместе с тем, если имеющийся материал изначально чист, пероксид в агаре позволит, как минимум, снизить число случаев скрытого заражения в полученных агаровых чашках.

Хранение штаммов

После того, как вы приобрели грибную культуру, вам придется найти способ долговременного хранения ее образцов, чтобы с них можно было начать работу заново, если что-то случится с активной культурой, которой вы пользуетесь в настоящее время. Простой метод хранения, которым пользуюсь я, предполагает соскабливание некоторого количества мицелия с агаровой чашки и перенос его в снабженную навинчивающимся колпачком пробирку со стерильной дистиллированной водой (спасибо Joe Kish за то, что он подсказал мне этот метод). Оказавшись в дистиллированной воде, мицелий переходит в состояние спячки (состояние покоя) и некоторые штаммы могут находиться в нем неопределенно долгое время (грибы типа вешенки, по моему опыту, могут храниться в таком виде около года). В этом случае даже не требуется охлаждение.

Несмотря на то, что традиционным способом хранения культур считаются пробирки с косым агаром, если вы не имеете доступа к жидкому азоту, пробирки не позволяют сохранять штаммы слишком долго – в лучшем случае, полгода.

Далее, когда вы готовите штаммы к длительному хранению, я не рекомендую при этом использовать пероксид водорода. Дело в том, что на самом деле я не знаю, какое влияние может оказать пероксид на культуры, находящиеся на хранении в течение длительного времени. Ускоряет ли он старение? Вызывает ли он постепенное ослабление штаммов и их генетические изменения? Я просто не исключаю, что могут быть проблемы с некоторыми видами, которые вы хотите сохранить. Кроме того, активно растущие культуры обладают лучшей защитной способностью против добавленного пероксида, чем находящиеся на хранении спящие культуры, которые могут оказаться более подверженными повреждениям. Поэтому, несмотря на то, что пробирки с косым агаром и пробирки с дистиллированной водой могут быть легко приготовлены с пероксидом, хранение штаммов без пероксида видится более безопасным. Приготовить пробирки с чистой дистиллированной водой очень просто. Разлейте воду по пробиркам, слегка накрутите колпачки и простерилизуйте пробирки в скороварке в течение получаса. Если у вас нет скороварки, попробуйте прокипятить пробирки в течение часа, добавив в них по несколько капель 3% пероксида. Пероксид убьет термоустойчивые споры, а длительное кипячение разрушит пероксид. В отличие от чашек петри, пробирки можно держать над пламенем при открывании и закрывании, что помогает сохранить стерильность без фильтрации атмосферы при переносах мицелия. Подготовленные к хранению пробирки я заворачиваю в пищевые пластиковые пакеты и отношу в подвал, где для их содержания предусмотрено безопасное место.

Инокуляция и уход за агаровыми культурами

Я провожу инокуляцию свежих чашек и пробирок, перенося в них с помощью скальпеля, простерилизованного в пламени спиртовки, небольшие кусочки обросшего мицелием агара, взятого из чашки, освоенной здоровой культурой. При использовании нагретого скальпеля для вырезания кусочков агара, я сперва охлаждаю скальпель, погружая его в агар на чашке, которая служит источником мицелия для переноса. Традиционный метод подразумевает охлаждение скальпеля путем погружения в агар на свежей, неиспользованной чашке. Нагретый скальпель может вызвать разложение пероксида в месте его погружения в агар. В нефильтрованном воздухе это место, будучи защищенным в меньшей степени, может стать исходной точкой для роста вредоносных микроорганизмов. Данное обстоятельство не является проблемой для чашки, из которой я произвожу перенос, потому что дальнейшее ее использование не предусмотрено. К свежей чашке указанная проблема относится в гораздо большей степени. Вот почему я охлаждаю скальпель в колонизированной чашке.

Если вы инокулируете чашку с использованием культуры, свободной от пероксида, не применяйте инокуляционную петлю, за исключением тех случаев, когда требуется выудить большой фрагмент мицелия. По моему опыту, незначительные фрагменты мицелия, извлеченные с помощью инокуляционной петли, не способны легко основать колонию в присутствии пероксида в концентрации, эффективной для борьбы с зараженьями, особенно если используемая культура не была выращена в присутствии пероксида. Мицелий имеет гораздо лучшие шансы на приживание, если его сгусток взят из пробирки с дистиллированной водой или кусочек агара с мицелием извлечен из пробирки при помощи скальпеля или другого заостренного инструмента (признаюсь, что доставать кусочки агара из пробирки при помощи скальпеля, по меньшей мере, неудобно).

Культуры, которые предварительно не подвергались воздействию пероксида, зачастую «замирают» на некоторое время, в течение которого мицелий адаптируется к новым условиям среды. Иногда мицелий начинает расти по направлению от пероксидного агара. Подобное поведение можно наблюдать, когда производится перенос мицелия из чашки, первоначально содержавшей пероксид, который затем подвергся разложению после полного освоения всей поверхности агара мицелием и последующей избыточной инкубации в течение нескольких дней. Тем не менее, рано или поздно мицелий адаптируется к новым условиям и начнет нормальный рост по всей поверхности свежей среды.

У меня никогда не было проблем со штаммами, которые длительное время находились в присутствии пероксида. Обычно я осуществляю до десяти переносов мицелия на пероксидсодержащую среду, после чего возвращаюсь к эталонным культурам, хранящимся без пероксида, хотя мой выбор этого числа переносов является произвольным, а возврат к эталонной культуре может быть совсем не обязательным.

Заметьте, что пероксид защищает только ту поверхность агаровой чашки, которая не содержит растущего на ней мицелия. Мицелий, сам по себе, является незащищенным, потому что он разлагает пероксид по мере своего роста. В этой связи, чашки с мицелием, который полностью освоил поверхность агара и далее продолжал свой рост в течение нескольких дней, с большей вероятностью содержат источники скрытого заражения.

Предотвращение скрытого заражения с помощью инокуляции нижней стороны агара.

При последовательных переносах мицелия в нефильтрованной атмосфере, в нем могут аккумулироваться контаминанты, даже если в агаре всегда присутствует пероксид, а мицелий никогда не осваивает всей поверхности чашки. Вы можете никогда не увидеть заражения, растущего на грибном мицелии в чашках, но при этом невидимые микроорганизмы будут понемногу обустраиваться на месте. Такое «тайное заражение» может представлять проблему вне зависимости от того, используете вы пероксид в посевном и основном субстрате, или нет. Естественно, что при использовании не защищенного пероксидом посевного или плодоносящего субстрата скрытые заражения могут расцвести на незащищенной среде с большей вероятностью.

Для того, чтобы предотвратить возможность такого скрытого заражения, я использую несложный прием: осуществляя переносы мицелия, я регулярно инокулирую нижнюю сторону агара (Как част… Продолжение »